Ihe ndị na-egbochi mmeghachi omume PCR

N'oge mmeghachi omume PCR, a na-ahụkarị ụfọdụ ihe ndị na-egbochi ya.
N'ihi oke mmetụta PCR, a na-ewere mmetọ dị ka otu n'ime ihe ndị kacha mkpa na-emetụta nsonaazụ PCR ma nwee ike ịkpata nsonaazụ ụgha.
Ihe dị oke mkpa bụ isi mmalite dị iche iche nke na-ebute nsonaazụ ụgha na-adịghị mma. Ọ bụrụ na e gbochie ma ọ bụ gbochie otu ma ọ bụ karịa akụkụ dị mkpa nke ngwakọta PCR ma ọ bụ mmeghachi omume mmụba n'onwe ya, a pụrụ igbochi nnwale nchọpụta ahụ. Nke a nwere ike ibute mbelata arụmọrụ na ọbụna nsonaazụ ụgha na-adịghị mma.
Tinyere mgbochi, mfu nke iguzosi ike n'ezi ihe nke nucleic acid nwere ike ime n'ihi ọnọdụ mbupu na/ma ọ bụ nchekwa tupu nkwadebe ihe nlele. Karịsịa, oke okpomọkụ ma ọ bụ nchekwa zuru oke nwere ike ibute mmebi nke mkpụrụ ndụ na nucleic acid. Idozi sel na anụ ahụ na itinye paraffin bụ ihe a maara nke ọma na-akpata nkewa DNA na nsogbu na-adịgide adịgide (lee Foto 1 na 2). N'ọnọdụ ndị a, ọbụna ikewapụ na nhicha kachasị mma agaghị enyere aka.

Foto nke 1 | Mmetụta nke immunization na iguzosi ike n'ezi ihe nke DNA
Elektrophoresis nke gel Agarose gosiri na ụdị DNA e kewapụrụ site na akụkụ paraffin nke ozu nwụrụ anwụ dị iche iche nke ukwuu. DNA nke ogologo iberibe dị iche iche dị na ihe ndị e wepụtara dabere na usoro nhazi. A na-echekwa DNA naanị mgbe edobere ya na ihe nlele oyi kpọnwụrụ akpọnwụ na formalin na-anọpụ iche. Ojiji nke formalin Bouin siri ike ma ọ bụ nke na-enweghị ihe mgbochi, nke nwere formalin nwere acidic kpatara nnukwu mfu nke DNA. Akụkụ fọdụrụ dị oke kewara ekewa.
N'aka ekpe, a na-egosi ogologo iberibe na ụzọ abụọ kilobase (kbp)

Foto nke 2 | Mfu nke iguzosi ike n'ezi ihe nke ihe mgbaru ọsọ nucleic acid
(a) Oghere 3′-5′ n'elu eriri abụọ ahụ ga-eme ka DNA ahụ gbawaa. Mmepụta DNA ka ga-eme na obere iberibe ahụ. Agbanyeghị, ọ bụrụ na ebe a na-eme ka praịmarị ghara ịdị na iberibe DNA ahụ, naanị mmụba ahịrị na-eme. N'ọnọdụ kachasị mma, iberibe ahụ nwere ike ime ka ibe ha juo, mana ihe a na-enweta ga-adị obere ma dị ala karịa ọkwa nchọpụta.
(b) Mfu nke ntọala, nke bụ isi n'ihi mwepụ na nhazi thymidine dimer, na-eduga na mbelata na ọnụọgụgụ nke H-bonds na mbelata na Tm. N'oge oge okpomọkụ ogologo oge, primers ga-agbaze na matrix DNA ma agaghị anyụ anyụ ọbụna n'okpuru ọnọdụ siri ike.
(c) Ntọala thymine dị n'akụkụ na-emepụta TT dimer.
Nsogbu ọzọ a na-ahụkarị nke na-emekarị na nchọpụta mkpụrụ ndụ ihe nketa bụ mwepụta nke nucleic acids ezubere iche na-erughị nke kacha mma ma e jiri ya tụnyere mwepụta phenol-chloroform. N'ọnọdụ ndị dị oke njọ, nke a nwere ike ijikọ ya na ihe ndị na-adịghị mma. Enwere ike ịchekwa oge dị ukwuu site na esi mmiri ọkụ ma ọ bụ mgbaze nke ihe mkpofu mkpụrụ ndụ, mana usoro a na-ebutekarị obere mmetụta PCR n'ihi enweghị ntọhapụ nucleic acid zuru oke.

Mgbochi nke ọrụ polymerase n'oge mmụba

N'ozuzu, a na-eji mgbochi eme ihe dị ka echiche akpa iji kọwaa ihe niile na-eduga na nsonaazụ PCR na-adịghị mma. N'echiche kemịkalụ kpọmkwem, mgbochi ahụ na-ejedebe naanị na ọrụ nke enzyme ahụ, ya bụ, ọ na-ebelata ma ọ bụ na-egbochi mgbanwe ngwaahịa substrate site na mmekọrịta na ebe DNA polymerase ma ọ bụ cofactor ya (dịka ọmụmaatụ, Mg2+ maka Taq DNA polymerase).
Ihe ndị dị na sample ma ọ bụ ihe nchekwa na ihe ndị e si na reagents wepụta nwere ike igbochi enzyme ahụ ozugbo ma ọ bụ jide cofactors ya (dịka EDTA), si otú a na-egbochi polymerase ma na-eduga na nsonaazụ PCR na-adịghị mma ma ọ bụ nke na-adịghị mma.
Agbanyeghị, a na-akpọkwa ọtụtụ mmekọrịta dị n'etiti ihe mmeghachi omume na asịd nucleic nwere ihe mgbaru ọsọ dị ka 'PCR inhibitors'. Ozugbo ikewapụ nke mkpụrụ ndụ mebiri site na nhapụ ma ewepụta nucleic acid, mmekọrịta dị n'etiti ihe nlele ahụ na ihe ngwọta gbara ya gburugburu na usoro siri ike nwere ike ime. Dịka ọmụmaatụ, 'ndị na-eme ihe nfụkasị' nwere ike ijikọ DNA otu ma ọ bụ nke nwere eriri abụọ site na mmekọrịta na-abụghị covalent ma gbochie ikewapụ na nhicha site na ibelata ọnụọgụgụ ihe mgbaru ọsọ ndị na-erute arịa mmeghachi omume PCR.
N'ozuzu, ihe mgbochi PCR dị n'ọtụtụ mmiri na ihe ndị e ji eme ihe maka nnwale ahụike (urea na mmamịrị, hemoglobin na heparin n'ọbara), ihe mgbakwunye nri (ihe ndị dị ndụ, glycogen, abụba, ion Ca2+) na ihe ndị dị na gburugburu ebe obibi (phenols, metal dị arọ)

Enwere ike ịchọta ihe mgbochi PCR ndị a na-ahụkarị na nje bacteria na mkpụrụ ndụ eukaryotic, DNA na-abụghị ihe mgbaru ọsọ, macromolecules nke DNA nke matrices anụ ahụ na akụrụngwa ụlọ nyocha dịka uwe aka na plastik. Ime ka acid nucleic dị ọcha n'oge ma ọ bụ mgbe ewepụrụ ya bụ ụzọ kachasị mma iji wepụ ihe mgbochi PCR.
Taa, ọtụtụ ngwa mwepụ akpaaka nwere ike dochie ọtụtụ usoro aka, mana 100% mgbake na/ma ọ bụ nhicha nke ihe mgbaru ọsọ emezubeghị. Ndị nwere ike igbochi nwere ike ka nọ na asịd nucleic dị ọcha ma ọ bụ nwee ike ịmalitela ọrụ. E nwere atụmatụ dị iche iche iji belata mmetụta nke ndị na-egbochi. Nhọrọ nke polymerase kwesịrị ekwesị nwere ike inwe mmetụta dị ukwuu na ọrụ ndị na-egbochi. Ụzọ ndị ọzọ a nwapụtara iji belata mgbochi PCR bụ ịbawanye njupụta polymerase ma ọ bụ itinye ihe mgbakwunye dịka BSA.
Enwere ike igosi mgbochi nke mmeghachi omume PCR site na iji njikwa mma usoro dị n'ime (IPC).
A ga-akpachara anya iji wepụ ihe ndị na-emepụta ihe na ihe ngwọta ndị ọzọ dị na ngwa mwepụta ahụ, dịka ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol na phenol, site na nukliic acid site na ịsacha nke ọma. Dabere na njupụta ha, ha nwere ike ime ka PCR rụọ ọrụ ma ọ bụ gbochie ya.